基于色谱法和电泳法建立饮料中索马甜的分析测试方法(一）等电点介于11.5～12.5之间-潮智云坊

知识

索马甜(也译作嗦吗甜、基于莎马甜，色谱索马Thaumatin)又称奇异果甜蛋白，法和法建分析方法是电泳从天然植物Thaurnatococcusdaniellii中提取出的超甜蛋白质，与其他植物来源的立饮料中具有甜味或能诱发甜味的蛋白质如莫内林(Monellin)、仙茅蛋白(库克灵，测试Curculin)161、基于马槟榔蛋白(马槟灵，色谱索马Mabinlin)、法和法建分析方法神秘果素(Miraculin)、电泳培它丁(Pentadin)191、立饮料中布拉齐因(Brazzein)等一起被称之为甜蛋白。测试相对于传统的基于碳水化合物糖类或化学合成甜味剂，这些天然甜蛋白一般具有甜度高、色谱索马热量低、法和法建分析方法口感好、安全无毒等优点，同时，还具有改善食品风味、可降解为人体所需的各种氨基酸以及不会引起血糖升高、蛀牙等特点，被认为非常具有发展前景的食品添加剂。研究表明，索马甜是由一个多基因家族编码、具有相似性质的蛋白，不同类型索马甜蛋白均由一条多肽链组成，含有207个氨基酸，但仅有5个或更少的氨基酸差异，分子量约为22kD，等电点介于11.5～12.5之间，目前已发现的包括ThaumatinI、ThaumatinII、Thaumatina、Thaumatinb、ThaumatinC等，其中ThaumatinI和ThaumatinII是最主要的成分。索马甜的甜度约是等质量蔗糖的3000倍，此外，还具有增强芳香和改善风味作用，与糖类等甜味剂共用有协同效应。索马甜产生甜味的机理与其结构中的Lys残基、羧基以及Asp-21和Phe-80形成的类天冬苯丙二肽酯位点等有密切关系。

目前，索马甜作为甜味剂、增味剂，在欧美国家和日本具有一定的使用规模，国内使用相对较少，根据我国现行的《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760-2014)，索马甜可以作为甜味剂在冷冻饮品(食用冰除外)、加工坚果与籽类、焙烤食品、餐桌甜味料、饮料类(包装饮用水除外)食品中限量使用，其最大允许使用量均为0.025g／kg。但是，由于索马甜的产量受制于资源、地域以及规模化生产条件，限制了其在食品加工中的使用，国内外已有不少利用基因工程技术对其基因进行克隆、通过蛋白表达的研究报道。

然而，国内尚无针对索马甜的检测方法标准，对其检测方法的报道也非常少，仅见方光伟等利用高效液相色谱一蒸发光检测器针对包括索马甜在内的甜味剂检测方法的研究。本文首次基于色谱法和电泳法建立饮料中索马甜的分析测试方法，其中所用色谱法以DAD为检测器较之通用型检测器具有选择性，可以起到一定的定性作用，此外，通过SDS-PAGE进一步印证，对于较为复杂的食品基质，能够获得更为可靠的结果。

一、仪器、试剂与方法

1、仪器与试剂

仪器设备：超高效液相色谱仪(1290)：美国Agilent公司；紫外可见分光光度计(Lambda35)：美国PerkinElmer公司；高速冷冻离心机(BiofugeStratos)：美国ThermoFisherScientific公司；Milli—Q超纯水装置：法国Millipore公司；电子天平(AL204／01)：METTLERTOLEDO公司；蛋白电泳系统Mini-PROTEINTetra：美国Bio-rad公司；超声波清洗器(KQ5200DE)：昆山市超声仪器有限公司；超滤管(15mL，10KD)：法国Millipom公司；0.45μm水系微孔滤膜购自上海安谱公司。

标准品与试剂：索马甜(纯度97.8％)购自日本TOKYOCHEMICALINDUSTRY公司；蛋白标样(MidRange)：BBI生命科学有限公司；5X蛋白上样缓冲液、甘氨酸、过硫酸铵、丙烯酰胺、N’，N’一甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、溴酚蓝、考马斯亮蓝、三氟乙酸：生工生物工程(上海)有限责任公司；甲醇、乙醇、乙酸均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；色谱纯乙腈：默克化工技术(上海)有限公司；试验所用不同种类饮料产品购于当地超市。

2、方法

（1）样品处理

饮料摇匀(其中碳酸类饮料提前超声5min除去二氧化碳)，取2.5mL移入到25mL容量瓶中，用水定容，在4℃下以8000r／min的转速离心10min，取上清液15mL到超滤管中进行超滤处理，轻轻冲洗滤膜，截留液定容至3mL，进行色谱分析前用0.45μm滤头过滤。

（2）紫外可见光谱扫描

以水为空白对照，对索马甜水溶液进行全波长扫描。扫描速度：120nm／min，分辨率：0.1nm，狭缝宽度：0.5nm，扫描范围：700～190nm。

（3）液相色谱条件

色谱柱：300SB-C18，RRHD1.8μm，100mm×2.1mm(i，d)；流动相：乙腈、0.1％三氟乙酸水溶液；流速：O.3mL／min；进样量：20μL；柱温：25℃。梯度洗脱：0～3min，乙腈10％～0.1％三氟乙酸水溶液90％；3～15min，乙腈(10％～100％)，0.1％三氟乙酸水溶液(90％～0％)；15.1～20min，乙腈(100％)；20.1～25min，乙腈10％～0.1％三氟乙酸水溶液90％。检测器：DAD，检测波长278.2nm，同时进行190～400nm波长扫描。

(4)标准曲线的制作

将索马甜分别用水稀释到浓度为10mg／L、25mg／L、50mg／L、100mg／L、200mg／L、500mg／L系列标准溶液，进行分析测定，以色谱峰面积与相应浓度绘制标准曲线回归方程。

(5)检出限和定量限

将不含索马甜的饮料稀释10倍，加入索马甜标准溶液，使其浓度在10mg／L，饮料摇匀(其中碳酸类饮料提前超声5min除去二氧化碳)，取2.5mL移入到25mL容量瓶中，用水定容，在4℃下以8000r／min的转速离心10min，取上清液15mL到超滤管中进行超滤处理，轻轻冲洗滤膜，截留液定容至3mL，进行色谱分析前用0.45pm滤头过滤。重复测定20次，以结果标准偏差的3倍计算出方法的检出限，以结果标准偏差的10倍计算出定量限。

(6)回收率和精密度

分别向不同类型饮料样品中添加25mg／L、50mg／L、200mg／L不同浓度的索马甜，每个加标样品按照所建立的方法重复测定6次，计算回收率和精密度。

(7)SDS—PAGE分析

分离胶浓度12.0％，电泳样品用5X蛋白上样缓冲液沸水处理5min，上样量60μL，电泳条件135V、50min，考马斯亮蓝染色。

二、结果

1、超高效液相色谱法分析索马甜方法的建立

（1）紫外可见光谱扫描结果

利用紫外可见分光光谱仪对索马甜溶液在700～190nm范围内进行扫描，结果如图1所示。

由图1可以看出，索马甜具有蛋白质类化合物典型的紫外可见光谱，由于蛋白质结构中芳香族氨墓酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的存在，使得其在280nm附近有特征吸收峰，在此区域最大吸收波长为278.2nm。虽然在200nm附近有更强的吸收，但由于大多数化合物在此区域有吸收，为避免干扰，选用278.2nm作为后续分析的依据。

（2）色谱条件及样品处理条件的确定

考虑索马甜蛋白质分子量超过20000kD，具有较大的尺寸，故选用适合蛋白质分析的大孔径色谱柱，本研究采用300SB—C18，RRHD1.8μm。通过对常用的甲醇、乙腈等流动相进行优化，最终确立了以0.1％三氟乙酸、乙腈作为索马甜液相分析的流动相。